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近日，《21羥化酶缺陷導致的先天性腎上腺皮質增生癥的實驗室診斷共識》正式發布，進一步規范了21-OHD的實驗室診斷?！豆沧R》高度肯定了三代CAH檢測技術。
01、21-OHD基因檢測難點
21-OHD是由CYP21A2基因的純合或復合雜合致病變異所致。CYP21A2 上游存在一個假基因CYP21A1P，真假基因外顯子序列的同源性高達98％，內含子的同源性達96％。
由于假基因與CYP21A2 序列高度同源且位置相近，CYP21A2 的變異多來源于真假基因之間的重組或微交換。重組所產生的真假融合基因，可能體現為相應真基因的不同范圍的缺失。不同的缺失導致的表型也有所差異，當缺失范圍包含與CYP21A2 毗鄰的TNXB 基因時，會導致患者合并EhlersＧDanos綜合征。因此需對斷裂點進行精準檢測，以幫助預測表型。
實驗室常采用Sanger測序+MLPA對21-OHD進行分子診斷。但由于CYP21A2 基因的復雜性和技術局限性，仍然存在Sanger測序＋MLPA漏檢的可能性。二代測序技術可以實現短片段(通常小于150 bp)的高通量測序，對序列特異性高的基因有較高的準確性。
然而，對于CYP21A2 基因而言，由于存在同源度極高的假基因，在分析數據時無法區分短片段的來源，導致二代測序結果不可靠。但二代測序技術對于非21-OHD的CAH病例有進一步鑒別診斷的作用。面對多個變異位點時，以上兩種解決方案都需要依賴家系驗證來區分變異位點的順反式關系。
02、三代測序CAH基因檢測優勢
共識對三代測序在CAH檢測中的的優勢進行了全面闡述。三代測序技術克服了二代測序讀長短的不足，測序最長讀長超過200 kb。其中PacBio測序平臺可通過對原始單分子模板(可達30 kb)進行多次測序，矯正單分子隨機測序的錯誤，獲得高準確性的一致性序列，再結合高深度測序（多個單分子模板）獲得準確的變異信息。
長片段多重PCR技術可以擴增CYP21A2、CYP21A1P 以及真假基因同源重組形成的基因缺失、基因重復和大片段基因轉換。三代測序可獲得每個PCR擴增片段的完整序列，從而有效區分真假基因，并準確地鑒定出點變異、Indel、缺失、重復和大片段基因轉換。
利用三代測序進行21-OHD基因檢測具有以下優勢：
利用同一反應體系同時檢測CYP21A2 基因所有類型的致病變異，包括復雜基因重復和大片段的基因轉換；
可以準確區分CYP21A2 和CYP21AIP，結果判讀直觀，不受真假基因同源性的干擾；
不依賴于家系基因型分析，可以直接分析兩個和多個變異之間的順反式關系；
可對融合基因進行一次性完整測序，能夠直觀地檢測出斷裂點。
03、實驗室目的及適用人群
首先，明確21-OHD的診斷對CAH的及時治療、改善預后及遺傳咨詢至關重要。21-OHD的實驗室診斷包括生化診斷和基因診斷。對于出現以下表現的患者，需要首先進行生化檢查，結合臨床表現判定診斷的方向，最終進行基因診斷。
圖2 診斷流程
21-OHD的生化診斷17α-OHP的水平檢測應在清晨（上午８點前）進行。對于育齡期女性，應在卵泡期進行類固醇激素的測量，其結果可能因檢測方法而異。經典型21-OHD的患者，包括21-OHD的SW型和SV型，其未經激發的17α-OHP值通常超過30nmol/L。需注意SV型和NC型的CAH患者17α-OHP水平可能難以區分。
圖3 適用人群
04、21-OHD的生化診斷
對CAH新生兒篩查陽性或臨床高度疑似的患者，檢測其類固醇激素及其前體代謝物的水平是診斷CAH的主要手段。
圖4 生化診斷
05、21-OHD的基因診斷
01 診斷難點
21-OHD是由CYP21A2基因的純合或復合雜合致病變異所致，CYP21A2基因編碼21羥化酶（P450C21），并有一個高度同源的假基因CYP21A1P；真假基因外顯子序列的同源性高達98%；內含子的同源性達96％，二者均定位于6p21.33區的HLA主要組織相容性復合體中。
圖5 真基因CYP21A2 和假基因CYP21A1P
造成的致病位點的差異
CYP21A2基因的變異類型變異包括錯義、無義、剪接位點變異、小插入缺失（indel），而且真假基因會發生復雜的同源重組。
圖6 復雜的同源重組
02 致病性評價標準
對于文獻中多次報道的致病變異以及在ClinVar等數據庫中被歸類為“致病”或“可能致病”的常見變異，無需進一步評估其致病性。
對于其他變異，包括已被ClinVar數據庫中收錄但不太常見的變異，須參照美國醫學遺傳學和基因組學學會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）指南。
03 基因型-表型相關性
多數研究認為，90％-95％的21-OHD患者的臨床表型與其所攜帶的CYP21A2的變異存在相關性。
04 基因診斷方法
要提醒注意的是，需明確CYP21A2基因有無致病變異，并明確攜帶致病變異的拷貝與正?？截愒趦蓷l等位基因上的分布情況，從而綜合判斷每條等位基因是否正常。
圖7 CYP21A2基因重復
對等位基因致病性判讀的影響
05 判讀錯誤的原因及解決方案
① 等位基因脫扣。需使用多對覆蓋CYP21A2基因的引物對真基因進行擴增，確保不會因引物特異性問題而導致漏檢；
② CYP21A2基因重復攜帶變異。重復拷貝若包含MLPA特異性結合位點的變異，可導致MLPA無法檢測出此重復。出現這種情況時，需仔細觀察測序峰圖，并結合MLPA的結果進行判斷。
③ 漏檢雜合攜帶者。CYP21A2基因的拷貝數盡管為２，但兩個CYP21A2基因位于同一條染色體上，另一條染色體為CYP21A2基因完全缺失。此時需結合家系數據和單倍型分析對CYP21A2基因在兩條等位基因上的分布進行準確的分析；
④ 在某些情況下，真假基因重組形成的融合基因可能被同時擴增，檢測到的致病變異可能被錯誤地定位到功能基因上。此時需采用多對覆蓋CYP21A2基因的引物對真基因進行擴增，并結合家系數據和單倍型分析對融合基因的結構進行準確的分析。
06、基于實驗室診斷的遺傳咨詢
21-OHD的遺傳咨詢可通過對先證者進行基因檢測，結合家族史，為患者家庭提供可能的疾病病程、家庭成員的遺傳狀況等信息。
圖8 實驗室診斷的遺傳咨詢流程
07、鑒別診斷
在大規模篩查中，具有高17α-OHP水平的其他CAH疾病包括PORD、３β-HSD和11β-OHD。
圖9 CAH鑒別診斷
結 語
本共識建議應重視并規范21-OHD的實驗室診斷方法，提供了各種生化及基因診斷方法的介紹及注意事項，并強調了基于實驗室診斷的遺傳咨詢，希望本共識可為國內同行提供參考。
參與本共識制定的人員，以單位和姓名為序
廣西醫科大學第二附屬醫院（陳少科、范歆）；
廣州市婦女兒童醫療中心（黃永蘭）；
首都醫科大學附屬北京兒童醫院（鞏純秀）
華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院（羅小平）；
三亞市婦幼保健院（王潔）；
南京市婦幼保健院（許爭鋒）；
上海市兒童醫院/上海交通大學醫學院附屬兒童醫院（鄒琳、李嬪）；
上海交通大學醫學院附屬國際和平婦幼保健院（王劍）；
復旦大學附屬兒科醫院（王藝）；
上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院（葉蕾）；
上海交通大學醫學院附屬新華醫院（梁黎黎、占霞、邱文娟、孫昱、余永國、顧學范）；
中南大學（鄔玲仟）；
浙江大學醫學院附屬兒童醫院（楊茹萊）；
參考文獻
中華醫學遺傳學雜志2023年7月第40卷第7期 ChinJMedGenet,July2023,Vol.40,No.7
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